Kit de detección de apoptosis-método de detección TUNEL

De hecho, en un sentido léxico estricto, existe una gran diferencia entre la muerte celular programada (PCD) y la apoptosis. La muerte celular programada es un concepto funcional que describe ciertas muertes celulares en un organismo multicelular como una parte normal predeterminada y estrictamente controlada de la ontogenia. La apoptosis es un concepto morfológico, que describe una forma de muerte celular que es completamente diferente de la necrosis con un conjunto completo de características morfológicas. Cambios morfológicos de la apoptosis celular: las membranas celulares y los orgánulos son relativamente completos. La picnosis del núcleo de izquierda a derecha es contracción nuclear, lisis nuclear y fragmentación nuclear. A continuación, aprendamos sobre el método de detección, medición y método de la apoptosis: según la clasificación, los métodos de detección de la apoptosis incluyen la detección morfológica, la detección de la función celular y la detección de marcadores bioquímicos. Entonces, ¿cuáles son las ventajas y desventajas de estos métodos? 1. Métodos de detección morfológica: 1) Observación de la estructura submicroscópica de orgánulos, microscopio electrónico: Ventajas: El estándar de oro para la detección de apoptosis. Desventajas: incapaz de cuantificar; procedimientos experimentales engorrosos 2) Tinción del núcleo y examen microscópico (Hoechst 33342) Ventajas: bajo costo, operación conveniente y cuantificable. Desventaja: Necesidad de contar las celdas. 2. Método de detección de la función celular: 1) Detección de potencial de membrana mitocondrial JC-1, ventajas de MitoTracker: adecuado para la detección de imágenes, los resultados de la tinción solo se pueden usar para determinar la línea. Desventajas: No se puede cuantificar si se pierde el potencial de la membrana mitocondrial. 2) Detección de fosfatidilserina en la superficie de la membrana celular. Ventajas de Annexin V-AbFluor 488 / PI: un método popular para la detección de apoptosis. Desventajas: Es necesario preparar una única suspensión celular para cuantificar la proporción de apoptosis en diferentes períodos. 3. Método de detección de marcadores bioquímicos 1) Detección de marcadores moleculares de apoptosis Detección de actividad de caspasa Ventajas de la detección de contenido de caspasa (WB): cribado de alto rendimiento y cuantitativo. 2) Detección de daños en el ADN. Ventajas del método TUNEL de electroforesis de ADN: Es adecuado para el estudio de apoptosis de muestras de cortes de tejido. Desventajas: la detección de electroforesis requiere mucho tiempo, no se puede cuantificar y tiene poca estabilidad. Método de detección combinado para una detección precisa de la apoptosis 1. El método de detección de Anexina V-AbFluor 488 / PI utiliza Anexina V-AbFluor 488 (fluorescencia verde) y PI (fluorescencia roja) juntos, que pueden distinguir con precisión la apoptosis temprana y la apoptosis tardía y las células muertas. Para este método, el procesamiento de muestras, las operaciones de tinción y la fotografía de fluorescencia determinan la precisión de la detección de apoptosis. Para muestras que no se utilizan y diferentes métodos de detección, se recomienda seguir la siguiente experiencia valiosa: 1. La clave de la fotografía de fluorescencia 1) Suspensión o resuspensión Tome fotografías de los portaobjetos líquidos. Resuspenda las células con una pequeña cantidad de PBS o solución de resuspensión para formar un concentrado celular. Pipetee 5-10 ul en un portaobjetos de vidrio anti-extracción limpio para hacer un frotis circular. Cubra el cubreobjetos e inmediatamente debajo del microscopio. Realice un examen microscópico. Preste atención a la velocidad durante el procesamiento para evitar que las células mueran. La densidad de resuspensión no es demasiado pequeña. Al untar, el volumen de la suspensión celular debe ser inferior a 10 ul. Se recomienda completar toda la operación en 10 minutos. 2) Hay una pequeña cantidad de tampón en la parte inferior de la placa pequeña de cultivo celular o la placa de foto-trepa para evitar rodajas secas. Asegúrese de limpiar suavemente antes de tomar fotografías para evitar que una limpieza inadecuada cause un fondo no específico durante el proceso de la fotografía. Las células Hela se indujeron con camptotecina durante 24 horas y se tiñeron con el kit de detección de apoptosis anexina V-AbFluor 488 (KTA0002). Pueden teñirse con Anexina V-AbFluor 488 / PI (membrana verde y núcleo del fragmento rojo) son células apoptóticas tempranas, necrosis o células apoptóticas tardías. 2. Pasos clave de la citometría de flujo 1) Evite los falsos positivos al digerir las células. Para prevenir falsos positivos, se recomienda la tripsina sin EDTA para digerir las células. 2) Configure el grupo de control. La cantidad medida en la citometría de flujo es un valor relativo, no un valor. Si desea conocer el valor, debe configurar un grupo de control, que incluye un control negativo y un control positivo. Se recomienda establecer un grupo de blanco y un grupo de control de grupo de tinción único de Annexin V-AbFluor 488 / PI cuando se realiza la prueba en la máquina, y el citómetro de flujo debe ajustarse con anticipación. 3) La cantidad de células a analizar debe ser moderada. Se recomienda preparar una cantidad suficiente de células. Generalmente, se recomienda preparar 1 × 106 células. Si hay muy pocas celdas, el flujo de muestra aumentará y el coeficiente de variación se verá afectado. El resultado no es exacto. Anticuerpos relativamente insuficientes od